MT-125通過(guò)抑制非肌肉肌球蛋白IIA與IIB延長(zhǎng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生存期

   膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是最致命的原發(fā)性腦腫瘤。本研究報(bào)道了一種非肌肉肌球蛋白II的小分子抑制劑MT-125。該化合物具有高腦滲透性和優(yōu)異的安全性特征，能阻斷GBM侵襲和胞質(zhì)分裂，延長(zhǎng)小鼠GBM模型的生存期。通過(guò)損害線(xiàn)粒體分裂，MT-125可增加氧化應(yīng)激及隨之產(chǎn)生的DNA損傷，并與放療產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。在氧化應(yīng)激驅(qū)動(dòng)機(jī)制下，MT-125還會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)PDGFR信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生癌基因成癮性，并與FDA批準(zhǔn)的PDGFR及mTOR抑制劑在體外產(chǎn)生協(xié)同作用。與此一致的是，我們發(fā)現(xiàn)將MT-125與PDGFR抑制劑舒尼替尼或磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/mTOR雙重抑制劑帕沙利西聯(lián)用，在原位GBM模型中的生存獲益顯著優(yōu)于單藥治療。我們的研究結(jié)果表明，MT-125作為首創(chuàng)新藥具有治療GBM的強(qiáng)大臨床潛力。本文于20205年8月發(fā)布于《Cell》, IF：42.5。

圖形摘要

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. MT-125是對(duì)NMIIA和NMIIB具有高選擇性的布比斯塔汀類(lèi)似物

   通過(guò)評(píng)估基于布比斯塔汀衍生的NMII抑制劑化合物庫(kù)，我們選擇了MT-125（圖1A）。該化合物對(duì)NMIIA（Ki,NMIIA = 2.7 ± 0.2 μM；圖1B）和NMIIB（EC50 = 1.7 ± 0.1 μM；圖1C）的抑制效力高度相似，在所有測(cè)試劑量下對(duì)正常細(xì)胞均無(wú)細(xì)胞毒性（圖1C紅色標(biāo)注），且對(duì)心肌球蛋白II（CMII）的抑制活性極低（KI,CMII = 50 ± 10 μM；圖1B）。我們前期工作預(yù)測(cè)這種對(duì)NMIIA/IIB的20-30倍選擇性將轉(zhuǎn)化為優(yōu)異的體內(nèi)耐受性。既往報(bào)道顯示，骨骼肌肌球蛋白II特異性衍生物MT-134（對(duì)CMII抑制較弱，KI,CMII = 83 μM）在體內(nèi)至少10 mg/kg的最高測(cè)試劑量下仍表現(xiàn)良好耐受性；另一種NMII抑制劑MT-228（KI,CMII = 17 μM）在劑量至少比布比斯塔?。↘I,CMII = 1.9 μM）高20倍時(shí)對(duì)心臟功能影響甚微。

圖1 MT-125具有NMIIA/IIB特異性、無(wú)毒性且可模擬NMII缺失表型

2.MT-125的藥代動(dòng)力學(xué)、代謝及安全性評(píng)價(jià)

   我們分析了MT-125的類(lèi)藥物特性。微粒體穩(wěn)定性研究預(yù)測(cè)其在體內(nèi)具有相對(duì)較短的半衰期，這是平衡耐受性與有效性的理想特性。MT-125與肝微粒體蛋白孵育后的代謝物鑒定表明，其在非臨床物種中的主要代謝途徑與人類(lèi)一致。此外，其細(xì)胞色素P450相互作用風(fēng)險(xiǎn)極低，且非P-糖蛋白底物，提示具有良好腦滯留性。在人醚相關(guān)基因-中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（hERG-CHO）電生理學(xué)檢測(cè)中，MT-125的IC50估計(jì)值大于10 μM；在作為心臟毒性附加評(píng)估的離子通道活性組中，對(duì)hERG、Nav1.5、Kv4.3/KChiP2、KCNQ1/mink及Kir2.1的抑制率均低于25%。結(jié)合其對(duì)CMII的微弱抑制，這些結(jié)果表明MT-125不會(huì)影響心臟功能，且具有符合藥物開(kāi)發(fā)推進(jìn)要求的選擇性特征。

   通過(guò)體內(nèi)特性分析確定了MT-125的最佳給藥途徑、腦滯留程度、藥代動(dòng)力學(xué)特性及耐受性。靜脈注射2 mg/kg時(shí)，MT-125的最大血藥濃度（Cmax）為5.45 ± 0.18 μM，曲線(xiàn)下面積（AUClast）為4.46 ± 0.14 μM·h，血漿半衰期（T1/2）為10.3小時(shí)，且耐受性良好無(wú)臨床不良反應(yīng)?？诜?0 mg/kg同樣耐受良好但生物利用度較低（Cmax = 0.72 ± 0.21 μM, AUClast = 1.44 ± 0.14 μM·h, T1/2 = 10.3 h）。因溶解度限制，更高口服劑量會(huì)形成懸浮液導(dǎo)致吸收不良。皮下注射（2、5和10 mg/kg）耐受性良好且系統(tǒng)暴露量?jī)?yōu)異，給藥后短時(shí)間內(nèi)腦部即達(dá)高濃度。例如5 mg/kg皮下注射后10分鐘內(nèi)（Tmax）腦內(nèi)濃度達(dá)9.1 ± 1.0 μM，為同期血漿濃度的兩倍（腦血濃度比B:P = 2.0）。此外，MT-125在注射后長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)仍維持可檢測(cè)的腦內(nèi)濃度（腦AUClast = 5.4 ± 0.8 μM·h，T1/2 = 10.5 h）。我們比較了10 mg/kg皮下與腹腔注射30分鐘后的血漿和腦藥物濃度：腹腔給藥的血漿濃度顯著較低（腹腔 = 0.7 ± 0.3 μM，皮下 = 2.5 ± 0.2 μM）。但由于僅評(píng)估單時(shí)間點(diǎn)，這些數(shù)值不代表實(shí)際Cmax，且兩種給藥途徑的藥代動(dòng)力學(xué)特征可能存在差異。但兩種方式均顯示優(yōu)異腦滲透性（如10 mg/kg時(shí)腦濃度：皮下 = 3.7 ± 0.3 μM, B:P = 1.5；腹腔 = 1.0 ± 0.3 μM, B:P = 1.6）。

3.MT-125在體內(nèi)表現(xiàn)出低毒性且具有良好治療指數(shù)

   小鼠每日皮下注射10 mg/kg MT-125連續(xù)兩周耐受性良好，體重?zé)o顯著變化（時(shí)間×處理交互作用：F(13, 91) = 1.5, p > 0.05），臨床化學(xué)與血液學(xué)指標(biāo)相較溶劑組均無(wú)異常（所有指標(biāo)p > 0.05）。為確定最大耐受劑量（MTD），大鼠單次皮下注射60、70或90 mg/kg MT-125。給藥1小時(shí)后采集血液進(jìn)行毒代動(dòng)力學(xué)分析，24小時(shí)后進(jìn)行血液學(xué)及臨床化學(xué)檢測(cè)。所有劑量組均未觀察到臨床不良反應(yīng)或體重變化（時(shí)間×處理交互作用：F(2, 6) = 1.1, p > 0.05）。給藥1小時(shí)后血漿濃度表明MT-125已被吸收（60 mg/kg組：4.8 ± 0.6 μM；70 mg/kg組：3.6 ± 0.4 μM；90 mg/kg組：4.4 ± 0.3 μM）。但各劑量組濃度相近提示60 mg/kg可能是單次皮下注射的最大可吸收劑量。所有臨床化學(xué)與血液學(xué)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。

   我們進(jìn)一步考察了溶劑與MT-125（20或40 mg/kg，皮下注射）每日重復(fù)給藥7天的效果。溶劑組和20 mg/kg MT-125組均未觀察到藥物相關(guān)不良反應(yīng)或?qū)φＤ挲g相關(guān)性體重增長(zhǎng)的影響（給藥期間溶劑組vs 20 mg/kg組，p > 0.05；7天恢復(fù)期溶劑組vs 20 mg/kg組，p > 0.05；圖1D）。雄性小鼠重復(fù)注射40 mg/kg后2-4小時(shí)出現(xiàn)輕微呼吸變化和流涎癥狀，均在30-60分鐘內(nèi)自行緩解。在此期間小鼠體重維持穩(wěn)定并在恢復(fù)期增長(zhǎng)（40 mg/kg雄性組：第1天vs第8天，p > 0.05；給藥期間溶劑組vs 40 mg/kg組，p < 0.0001；7天恢復(fù)期溶劑組vs 40 mg/kg組，p > 0.05；圖1D）。雌性小鼠未出現(xiàn)健康異?；蝮w重變化（第1天vs第8天，p > 0.05；圖1D）。治療7天后及7天恢復(fù)期后，所有組的臨床化學(xué)和血液學(xué)指標(biāo)均正常（圖1E、1F）。通過(guò)第1天（圖1G）和第7天（圖1H）0.5-24小時(shí)內(nèi)6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的毒代動(dòng)力學(xué)評(píng)估（第7天加測(cè)給藥前濃度），觀察到預(yù)期的劑量依賴(lài)性血漿濃度升高，且無(wú)性別差異。40 mg/kg組雄性AUClast為20.4 ± 2.1 μM·h，雌性為17.0 ± 1.7 μM·h（p > 0.05）。給藥7天后可見(jiàn)輕微蓄積現(xiàn)象，末次給藥前血漿濃度為0.43 ± 0.05 μM（圖1H）。

   我們?cè)诹己脤?shí)驗(yàn)室規(guī)范（GLP）條件下對(duì)雌雄大鼠進(jìn)行了28天重復(fù)給藥的毒理學(xué)研究，劑量為7.5、15和30 mg/kg（皮下注射）。在所有評(píng)估指標(biāo)（包括臨床觀察、體重、攝食量、眼科檢查、中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能觀察組合測(cè)試（FOB）、臨床病理學(xué)和組織病理學(xué)）中，MT-125均表現(xiàn)良好耐受性。所有動(dòng)物在給藥期間體重均增長(zhǎng)，其中15和30 mg/kg組雄性大鼠體重增速稍緩，停藥后恢復(fù)（雙因素方差分析組間效應(yīng)：雄性給藥期間F(3,72)=3.1, p<0.05；第22天溶劑組vs 15 mg/kg組p<0.05，溶劑組vs 30 mg/kg組p<0.001；第28天溶劑組vs 15 mg/kg組p<0.001，溶劑組vs 30 mg/kg組p<0.0001；其余比較無(wú)顯著性；雄性恢復(fù)期F(2,12)=2.5, p>0.05；雌性給藥期間F(3,72)=0.5, p>0.05；雌性恢復(fù)期F(2,12)=2.9, p>0.05）。兩性別均出現(xiàn)輕微超出正常范圍的血糖和甘油三酯降低，其余指標(biāo)均正常。毒代動(dòng)力學(xué)測(cè)試確定30 mg/kg劑量對(duì)應(yīng)Cmax=3.44 μM（給藥后30分鐘）和AUClast=15.40 μM·h。在28天給藥期及后續(xù)28天恢復(fù)期內(nèi)，所有劑量組均未記錄到顯著或持續(xù)的健康損害。由此確定未見(jiàn)不良反應(yīng)劑量（NOAEL）為最高測(cè)試劑量30 mg/kg（皮下注射）。

4.MT-125可模擬NMII缺失對(duì)GBM侵襲與增殖的效應(yīng)并延長(zhǎng)小鼠GBM模型生存期

   為驗(yàn)證MT-125抑制侵襲的效果是否與布比斯塔汀相當(dāng)，我們檢測(cè)了1個(gè)小鼠（MES1861）和3個(gè)人類(lèi)（187、190和L1）GBM細(xì)胞系在溶劑（DMSO）或5 μM MT-125處理8小時(shí)后穿過(guò)3 μm Transwell小孔的體外侵襲能力（圖1I）。MT-125在所有細(xì)胞系中均顯著抑制Transwell侵襲（p < 0.0001）。NMII同時(shí)參與胞質(zhì)分裂過(guò)程，其抑制會(huì)導(dǎo)致多核化和非整倍體形成。與此一致，5 μM MT-125處理48小時(shí)后，10個(gè)人類(lèi)GBM細(xì)胞系中12%-25%的細(xì)胞出現(xiàn)多核化現(xiàn)象（圖1J、1K）（所有MT-125處理組vs溶劑組p < 0.0001，雙尾t檢驗(yàn)）。

   為探究MT-125對(duì)細(xì)胞核大小和數(shù)量的影響能否作為體內(nèi)藥物-靶點(diǎn)結(jié)合的生物標(biāo)志物，我們采用基因工程小鼠模型（GEMM）——通過(guò)向攜帶條件性敲除腫瘤抑制基因（如Trp53或Pten）的小鼠原位注射編碼PDGFbb-HA融合蛋白和cre重組酶的反轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建。該模型可100%形成 proneural 型、異檸檬酸脫氫酶（IDH）野生型、O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）非甲基化的GBM，且具有完全致死性。我們對(duì)Trp53(?/?)腫瘤小鼠每日腹腔注射溶劑或10 mg/kg MT-125連續(xù)14天，取腦組織切片進(jìn)行H&E染色（圖2A、2B）。MT-125誘導(dǎo)了多核化現(xiàn)象（圖2B白色箭頭）并使平均核橫截面積增加53%（圖2C, p < 0.0001）。我們另用溶劑或MT-125處理Trp53、Pten單敲或雙敲除的小鼠GBM細(xì)胞系及7個(gè)人類(lèi)GBM細(xì)胞系120小時(shí)，采用ATP檢測(cè)法（CellTiter Glo，Promega）評(píng)估細(xì)胞毒性（圖2D）。其中三個(gè)人類(lèi)系（L0、L1和GBM1A）具有腫瘤起始細(xì)胞特征（圖2E）。各細(xì)胞系的細(xì)胞毒效應(yīng)EC50值為1-5 μM。結(jié)合藥代動(dòng)力學(xué)研究中的腦內(nèi)濃度數(shù)據(jù)，我們預(yù)測(cè)2-10 mg/kg劑量在體內(nèi)應(yīng)具有療效。

圖2 MT-125對(duì)GBM具有治療活性

   為評(píng)估MT-125的治療潛力，我們?cè)诜崔D(zhuǎn)錄病毒原位注射7天后開(kāi)始，每日對(duì)Trp53(?/?) GEMM模型進(jìn)行腹腔注射溶劑或2、5、10 mg/kg MT-125（圖2F），持續(xù)治療至發(fā)病。獲得的 Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)表明，三種劑量MT-125單藥治療均較溶劑組延長(zhǎng)中位生存期（三種劑量vs溶劑組p < 0.011，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)）。盡管存在劑量遞增延長(zhǎng)生存期的趨勢(shì)，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。我們另通過(guò)皮下注射2 mg/kg MT-125驗(yàn)證其在該模型中的療效，同樣顯著延長(zhǎng)生存期（圖2G；p < 0.0001，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)）。因此將2 mg/kg設(shè)定為最低有效劑量（MED）。雌雄小鼠皮下注射2 mg/kg的藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)試顯示，該劑量下的生存獲益僅需0.98 ± 0.2 μM·h的血漿AUClast濃度支持。給藥30分鐘后腦內(nèi)MT-125濃度為0.4 ± 0.04 μM，且無(wú)性別差異。結(jié)合毒理學(xué)數(shù)據(jù)顯示每日給藥28天的NOAEL >30 mg/kg（圖1D–1F），皮下或腹腔注射低至2 mg/kg劑量即可產(chǎn)生療效，表明MT-125具有優(yōu)于15倍的長(zhǎng)期給藥治療指數(shù)。

5.MT-125誘導(dǎo)氧化還原介導(dǎo)的細(xì)胞毒性及放射增敏效應(yīng)

   約10 μM劑量MT-125（圖2D、2E）在多種鼠源及人源GBM細(xì)胞系中產(chǎn)生>90%細(xì)胞毒性，但對(duì)正常細(xì)胞無(wú)影響（圖1C）。鑒于DNA斷裂是多種細(xì)胞死亡形式的特征，我們檢測(cè)了MT-125對(duì)裂解聚 ADP 核糖聚合酶（PARP）與磷酸化H2AX（γH2AX）水平的影響。在MT-125處理的Trp53(?/?)細(xì)胞中（圖3A），兩者均升高且可被抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）逆轉(zhuǎn)。此外，敲除NMIIA或NMIIB足以使γH2AX增加6倍以上（圖3B），表明該效應(yīng)非脫靶作用。MT-125還在5種低傳代人類(lèi)GBM細(xì)胞系中增加γH2AX（圖3C）。共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變（ATM）蛋白響應(yīng)DNA損傷磷酸化H2AX，ATM抑制劑AZD1390在鼠源Trp53(?/?) GBM細(xì)胞系中阻斷了MT-125誘導(dǎo)的γH2AX升高（圖3D）。這些變化與裂解 caspase 3的表達(dá)同步出現(xiàn)（圖3E），提示MT-125誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖3 MT-125誘導(dǎo)氧化還原介導(dǎo)的細(xì)胞毒性及放射敏感性

   NMII的線(xiàn)粒體分裂調(diào)控功能可解釋上述發(fā)現(xiàn)——該質(zhì)量控制機(jī)制可清除受損線(xiàn)粒體膜，防止活性氧（ROS）泄漏至胞質(zhì)與細(xì)胞核。為驗(yàn)證MT-125是否增加胞質(zhì)ROS，我們?cè)赗OS敏感熒光探針CellRox Green存在下處理鼠源Trp53(?/?)和人源L1 GBM細(xì)胞，并用Hoechst復(fù)染。MT-125使鼠源（圖3F）和人源細(xì)胞系（圖3G）的標(biāo)準(zhǔn)化CellRox Green信號(hào)增強(qiáng)67%-77%。若該ROS升高源于MT-125抑制線(xiàn)粒體分裂，則其應(yīng)同時(shí)延長(zhǎng)線(xiàn)粒體長(zhǎng)度。我們使用MitoTracker Green染色鼠源和人源GBM細(xì)胞系，每組測(cè)量8個(gè)細(xì)胞的線(xiàn)粒體長(zhǎng)度。MT-125在兩類(lèi)細(xì)胞系中均顯著增加線(xiàn)粒體長(zhǎng)度（圖3H）。ROS還可通過(guò)鐵死亡過(guò)程過(guò)氧化膜脂損害細(xì)胞膜完整性，該過(guò)程需ROS和氧化還原活性鐵共同參與。為驗(yàn)證MT-125是否誘導(dǎo)鐵死亡，我們用定位細(xì)胞膜的熒光探針BodipyC11（脂質(zhì)過(guò)氧化時(shí)熒光發(fā)射從紅移向綠光）處理鼠源GBM細(xì)胞。與溶劑相比，EC50濃度（4 μM）MT-125處理48小時(shí)使綠/紅熒光比率增加近一倍（圖3I），該效應(yīng)可被鐵死亡抑制劑ferrostatin 1或ROS清除劑維生素C逆轉(zhuǎn)。為探究鐵死亡抑制劑是否阻斷MT-125細(xì)胞毒性，我們用溶劑、兩種鐵死亡抑制劑（螯合氧化還原鐵的deferoxamine和ferrostatin 1）、4 μM MT-125或4 μM MT-125+鐵死亡抑制劑處理鼠源Trp53(?/?) GBM細(xì)胞120小時(shí)，并通過(guò)CellTiter Glo檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果如圖3J（deferoxamine）和圖3K（ferrostatin 1）所示，兩種抑制劑均幾乎完全逆轉(zhuǎn)MT-125的細(xì)胞毒性。

   放射治療作為GBM標(biāo)準(zhǔn)療法，通過(guò)多種機(jī)制殺傷腫瘤細(xì)胞，其中部分機(jī)制依賴(lài)ROS生成（包括鐵死亡），提示MT-125可能與放療協(xié)同。我們?cè)谑笤碩rp53(?/?) GBM細(xì)胞系中開(kāi)展體外驗(yàn)證（圖3L、3M）。10 Gy照射、NAC（圖3L）或ferrostatin 1（圖3M）處理對(duì)細(xì)胞活力無(wú)顯著影響。4 μM MT-125使細(xì)胞數(shù)降至約50%，聯(lián)合10 Gy照射進(jìn)一步顯著降低細(xì)胞數(shù)。NAC或ferrostatin 1不僅阻斷MT-125細(xì)胞毒性，還顯著減弱MT-125聯(lián)合10 Gy照射的效果。最后我們?cè)谂R床前鼠源Trp53(?/?) GEMM模型中考察MT-125聯(lián)合放療的治療效果（圖3N）。在該放射抗性模型中，5天每日2 Gy照射對(duì)生存無(wú)影響，而MT-125單藥（每日10 mg/kg）顯著延長(zhǎng)生存期，復(fù)現(xiàn)了早期結(jié)果（圖2F、2G）。MT-125聯(lián)合放療進(jìn)一步延長(zhǎng)生存期，其效果超過(guò)放療與MT-125單藥效應(yīng)的總和。

6. NMIIA通過(guò)ROS調(diào)控PDGFR信號(hào)傳導(dǎo)

   NMIIA缺失會(huì)抑制致癌激酶信號(hào)傳導(dǎo)，這提示抑制NMII應(yīng)增強(qiáng)受體酪氨酸激酶（RTK）信號(hào)。為驗(yàn)證此假設(shè)，我們用5 μM MT-125處理Trp53(?/?)細(xì)胞48小時(shí)。MT-125使PDGFRα及pY849 PDGFRα的表達(dá)量增加2-3倍（圖4A、4C）。NMIIA缺失也使PDGFRα表達(dá)升高7倍（圖4D），證實(shí)該效應(yīng)非脫靶作用。MT-125或NMIIA缺失還使AKT（S473）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）（T2446）和S6激酶（T389）的磷酸化水平升高2-4倍（圖4E–4I）。由于mTOR是蛋白質(zhì)翻譯的核心調(diào)控因子，我們推測(cè)MT-125激活mTOR可能促進(jìn)PDGFRα生成。為驗(yàn)證此點(diǎn)，我們用MT-125聯(lián)合兩種mTOR抑制劑（TOR復(fù)合體1/2抑制劑AZD8055和TORC1抑制劑依維莫司）處理Trp53(?/?)細(xì)胞。兩種抑制劑均阻止MT-125誘導(dǎo)的PDGFRα表達(dá)增加（圖4J）。為探究mTOR激活的作用機(jī)制，我們構(gòu)建了在Rpl22核糖體亞基上表達(dá)RiboTag表位的Trp53(?/?) GBM細(xì)胞系，并用溶劑或5 μM MT-125處理。通過(guò)抗HA pull-down分離多聚核糖體后，采用qRT-PCR檢測(cè)編碼PDGFRα的總mRNA及多聚核糖體結(jié)合mRNA水平。結(jié)果顯示（圖4K），MT-125特異性使PDGFRα的多聚核糖體mRNA增加近50%（p = 0.0034，雙尾t檢驗(yàn)）。

圖4 NMII通過(guò)ROS調(diào)控PDGFR信號(hào)傳導(dǎo)

   有研究報(bào)道NMIIA可與PI3K的α亞基（PIK3CA）結(jié)合并抑制其活性，該作用可被NMIIA抑制逆轉(zhuǎn)7，這或許能解釋MT-125增強(qiáng)AKT、mTOR和S6K激活的現(xiàn)象（圖4E–4I）。為驗(yàn)證此機(jī)制，我們用抗NMIIA抗體對(duì)Trp53(?/?) GBM細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫沉淀，并通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC/MS-MS）分析沉淀物。蛋白質(zhì)組學(xué)分析未檢測(cè)到NMIIA-PIK3CA結(jié)合的證據(jù)。第二種可能機(jī)制與NMII在受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用中的已知功能相關(guān)——其通過(guò)后續(xù)細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸將受體運(yùn)至溶酶體降解35。為驗(yàn)證此點(diǎn)，我們用溶劑或MT-125處理Trp53(?/?)鼠源GBM細(xì)胞，并添加10 μM cycloheximide阻斷蛋白質(zhì)合成后檢測(cè)PDGFRα表達(dá)隨時(shí)間的變化。對(duì)溶劑（圖4L藍(lán)色）和MT-125（圖4L紅色）數(shù)據(jù)進(jìn)行單指數(shù)衰減擬合（圖4L實(shí)線(xiàn)曲線(xiàn)）顯示，兩條曲線(xiàn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異（p = 0.12；數(shù)據(jù)對(duì)數(shù)變換后雙尾t檢驗(yàn)），表明MT-125未顯著延長(zhǎng)總PDGFRα的半衰期。然而，第三種機(jī)制將MT-125對(duì)線(xiàn)粒體功能的影響與信號(hào)傳導(dǎo)相聯(lián)系：除影響DNA和細(xì)胞膜完整性外，ROS通過(guò)氧化滅活蛋白酪氨酸磷酸酶中兩個(gè)反應(yīng)性半胱氨酸，激活RTK依賴(lài)性信號(hào)傳導(dǎo)，從而延長(zhǎng)磷酸化激活態(tài)RTK的存續(xù)時(shí)間。我們重復(fù)cycloheximide周轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)并檢測(cè)激活態(tài)pY849 PDGFRα，發(fā)現(xiàn)MT-125使pY849 PDGFRα的周轉(zhuǎn)速率降低3倍以上（圖4M；p = 0.018，數(shù)據(jù)對(duì)數(shù)變換后雙尾t檢驗(yàn)）。若MT-125誘導(dǎo)的PDGFRα信號(hào)激活依賴(lài)于ROS，則可預(yù)測(cè)MT-125的信號(hào)效應(yīng)（包括PDGFRα上調(diào)和PDGFRα、AKT及mTOR的激活磷酸化）應(yīng)可被ROS清除劑（如L-抗壞血酸維生素C）逆轉(zhuǎn)。圖4N–4Q結(jié)果證實(shí)了這一預(yù)測(cè)。但另一種可能是維生素C作為還原劑通過(guò)化學(xué)反應(yīng)修飾并滅活MT-125。為排除此干擾，我們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育MT-125（含/不含維生素C）。MT-125在3天孵育期間降解極微，無(wú)論是否存在維生素C均有>90%化合物保持完整。

7.NMIIA調(diào)控自身表達(dá)及MAPK依賴(lài)性信號(hào)傳導(dǎo)  

   由于NMII沿PDGFR-PI3K-AKT-mTOR信號(hào)軸調(diào)控活性，我們檢測(cè)了NMIIA或NMIIB表達(dá)是否受mTOR調(diào)控。用三種mTOR抑制劑（AZD8055、依維莫司和帕沙利西）及PDGFR抑制劑舒尼替尼處理鼠源和人源GBM細(xì)胞系，Trp53(?/?)和Pten(?/?) GEMM細(xì)胞系結(jié)果如圖5A、5B所示。直接或通過(guò)PDGFR間接抑制mTOR使NMIIA含量降低約2倍，但不影響NMIIB。若NMII抑制RTK信號(hào)而mTOR激活增加NMIIA，則MT-125通過(guò)間接激活mTOR也應(yīng)增強(qiáng)NMII表達(dá)。與此一致，我們發(fā)現(xiàn)（圖5C）MT-125使NMIIA蛋白水平升高約60%。利用RiboTag Trp53(?/?) GBM細(xì)胞系檢測(cè)MT-125是否改變編碼NMIIA和IIB（分別為Myh9和Myh10）的核糖體結(jié)合mRNA水平。MT-125使NMIIA多聚核糖體mRNA增加約50%，但對(duì)NMIIB mRNA無(wú)影響（圖5D、5E）。

圖5 NMIIA表達(dá)受mTOR調(diào)控并調(diào)控MAPK通路

   RAS和SRC激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，并可被RTK活性激活。因此我們檢測(cè)MT-125是否刺激MAPK信號(hào)。MT-125處理Trp53(?/?)細(xì)胞系使激活態(tài)RAS含量翻倍（圖5F），相同處理使Trp53(?/?)和Pten(?/?)細(xì)胞的ERK1/2（圖5G）和SRC（圖5H）磷酸化水平增加2-3倍。我們?cè)?種低傳代人源GBM細(xì)胞系中也檢測(cè)到MT-125增強(qiáng)PDGFRα、AKT、mTOR、ERK1/2和SRC的激活。

   MAPK通路也受整合素調(diào)控——整合素作為牽引力敏感的機(jī)械感受器，受NMII產(chǎn)生的力調(diào)控。NMII可通過(guò)誘導(dǎo)活性構(gòu)象變化激活整合素，但也可在較高作用力下使整合素與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）脫離連接從而滅活之。抑制NMIIA和IIB介導(dǎo)的整合素解離時(shí)，MT-125可能激活整合素信號(hào)，進(jìn)而激活MAPK通路。為此我們?cè)趦煞N層粘連蛋白包被的基底上培養(yǎng)Trp53(?/?)細(xì)胞：組織培養(yǎng)塑料和具有2 kPa剛度（與宏觀腦組織剛度相近）的聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜。用溶劑或5 μM MT-125處理這些細(xì)胞48小時(shí)，并用兩種小鼠特異性單克隆抗體染色：一種識(shí)別活性β1整合素亞基表位（克隆9EG7，BD Biosciences），另一種識(shí)別總β1整合素（克隆HMβ1-1，Biolegend）。硬質(zhì)（塑料）和軟質(zhì)（2 kPa PDMS）基底上抗活性β1/總β1整合素的熒光強(qiáng)度比值分別見(jiàn)圖5I和5J（右側(cè)），顯示MT-125降低硬質(zhì)和軟質(zhì)表面上活性β1整合素的比例（p < 0.0001，雙尾t檢驗(yàn)），這與NMII在黏著斑成熟中的作用一致。該發(fā)現(xiàn)排除了整合素在MT-125激活MAPK信號(hào)中的顯著貢獻(xiàn)。

8. MT-125與致癌激酶抑制劑在體外產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)  

   我們整合研究結(jié)果構(gòu)建了一個(gè)模型：NMII參與兩條關(guān)鍵致癌信號(hào)通路（圖6A）。MT-125通過(guò)ROS效應(yīng)間接增強(qiáng)PDGFR信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而激活mTOR。由于mTOR上調(diào)PDGFRα表達(dá)，這將形成正反饋循環(huán)——mTOR上調(diào)增強(qiáng)PDGFRα表達(dá)，進(jìn)一步強(qiáng)化PI3K活性。但mTOR通過(guò)調(diào)控NMIIA表達(dá)為該循環(huán)提供制動(dòng)機(jī)制。MT-125通過(guò)解除該制動(dòng)，同時(shí)增強(qiáng)RTK-PI3K-AKT-mTOR和MAPK信號(hào)傳導(dǎo)。這兩條通路通過(guò)至少兩個(gè)層面的激活相互作用連接：一方面是PDGFRα、SRC和RAS之間的相互作用，另一方面是ERK1/2與mTOR之間的相互作用。與此一致，我們發(fā)現(xiàn)用PDGFR抑制劑舒尼替尼處理Trp53(?/?)細(xì)胞可降低AKT磷酸化、mTOR磷酸化、RAS和SRC活性（圖6B–6E）。此外，用ERK1/2抑制劑SCH772984（圖6F）處理這些細(xì)胞可降低mTOR磷酸化水平，即使在MT-125存在下亦然（圖6G）。

圖6 MT-125在體外與致癌信號(hào)抑制劑產(chǎn)生協(xié)同作用

   腫瘤細(xì)胞可能對(duì)其上調(diào)的致癌通路產(chǎn)生依賴(lài)性（即"癌基因成癮"現(xiàn)象），這提示MT-125與RTK-PI3K-AKT-mTOR信號(hào)抑制劑聯(lián)用可能更有效。我們通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：用MT-125+舒尼替尼及MT-125+依維莫司聯(lián)合處理Trp53(?/?) GBM細(xì)胞，96小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量。采用MuSyC算法（可解析效能與效價(jià)協(xié)同作用）分析結(jié)果。該算法通過(guò)擬合藥物組合數(shù)據(jù)的劑量反應(yīng)曲面，計(jì)算協(xié)同效能程度（β）及協(xié)同效價(jià)程度（log[α12]和log[α21]）。MT-125使舒尼替尼效價(jià)提高1.6倍（圖6H；log[α21] = 0.19），依維莫司效價(jià)提高1.5倍（圖6J；log[α21] = 0.18）；而舒尼替尼使MT-125效價(jià)提高8.5倍（圖6H；log[α12] = 0.93），依維莫司使其提高132倍（圖6I；log[α21] = 2.12）。劑量反應(yīng)曲面中的洋紅色區(qū)域表示觀察到協(xié)同作用的藥物組合。與單藥相比，MT-125與舒尼替尼或依維莫司聯(lián)用分別使細(xì)胞數(shù)量減少42%（β = 0.42）和59%（β = 0.59）。此外，基因敲除NMIIA也使Pten(?/?) GBM細(xì)胞對(duì)舒尼替尼（圖6I）和依維莫司（圖6K）更敏感。最后我們篩選MT-125與5種低傳代人源GBM細(xì)胞系的協(xié)同作用：用溶劑、MT-125（5 μM）、舒尼替尼（400 nM）或聯(lián)合處理48小時(shí)，通過(guò)CellTiter Glo檢測(cè)細(xì)胞活力。所有細(xì)胞系均表達(dá)PDGFRα。舒尼替尼與MT-125聯(lián)用使所有細(xì)胞系的活力降低近2倍，效果顯著優(yōu)于單藥（p < 0.0001）。

9. MT-125與致癌激酶抑制劑在體內(nèi)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)  

   我們誘導(dǎo)Trp53缺失的GEMM模型，隨機(jī)分組小鼠接受溶劑（DMSO，每日腹腔注射）、10 mg/kg MT-125（每日腹腔注射）、40 mg/kg舒尼替尼（每周5天口服灌胃）或舒尼替尼+MT-125聯(lián)合治療（7天后開(kāi)始）。治療4周后處死小鼠，取反轉(zhuǎn)錄病毒注射水平的冠狀腦切片進(jìn)行H&E染色和抗HA抗體染色以觀察分泌PDGF的腫瘤細(xì)胞。與溶劑處理（圖7A）相比，MT-125處理組（圖7B）的GBM體積顯著縮小。如我們既往報(bào)道53，舒尼替尼治療（圖7C）增強(qiáng)腫瘤播散，在對(duì)側(cè)半球深部出現(xiàn)PDGF陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞巢（圖7D），可見(jiàn)于鉛筆纖維束內(nèi)（黑色箭頭）。而舒尼替尼+MT-125聯(lián)合治療（圖7E）顯著縮小腫瘤體積，僅存孤立HA陽(yáng)性細(xì)胞巢（圖7E黑色箭頭，圖7F放大顯示）。

圖7 MT-125在體內(nèi)與致癌信號(hào)抑制劑產(chǎn)生協(xié)同作用

   以相同方式處理第二批小鼠并觀察生存期。舒尼替尼（圖7G洋紅色）或MT-125（圖7G綠色）單藥治療較溶劑組（圖7G藍(lán)色）延長(zhǎng)中位生存期約33%（p < 0.0001，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)），但所有動(dòng)物最終均死于腫瘤。而兩藥聯(lián)合（圖7G紅色）使中位生存期較溶劑組延長(zhǎng)2倍（p < 0.0001，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)），并在約40%小鼠中產(chǎn)生長(zhǎng)期緩解。MT-125+舒尼替尼給藥至第85天停止，該組后續(xù)無(wú)死亡事件。為評(píng)估聯(lián)合治療的生存獲益在多大程度上依賴(lài)淋巴細(xì)胞，我們從圖7G所用Trp53(?/?) GEMM中建立原代鼠源Trp53缺失GBM細(xì)胞系，將其原位接種至NSG小鼠，并按圖7G方案處理。舒尼替尼（圖7H洋紅色）或MT-125（圖7H綠色）單藥治療較溶劑組（圖7H藍(lán)色）延長(zhǎng)中位生存期（MT-125 vs溶劑p = 0.002；舒尼替尼vs溶劑p = 0.006，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)）。但MT-125與舒尼替尼聯(lián)合（圖7H紅色）仍比單藥更有效（p < 0.026，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)），并在約25%小鼠中產(chǎn)生長(zhǎng)期緩解。根據(jù)圖6A模型預(yù)測(cè)，抑制PDGFRα下游致癌激酶的藥物與MT-125聯(lián)用也應(yīng)增強(qiáng)生存獲益。我們?cè)赥rp53(?/?) GEMM中使用帕沙利西（一種可透過(guò)血腦屏障的PI3K/mTOR雙重抑制劑）驗(yàn)證該預(yù)測(cè)。帕沙利西+MT-125聯(lián)合治療較單藥延長(zhǎng)中位生存期（圖7I；p < 0.0001，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)）。最后我們?cè)诨颊邅?lái)源異種移植（PDX）模型中重復(fù)該治療方案：給NSG小鼠原位接種50,000個(gè)L1人源GBM細(xì)胞（圖7J），接種后第7天開(kāi)始治療。舒尼替尼單藥對(duì)中位生存期無(wú)影響（p = 0.75，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)），MT-125單藥較溶劑組延長(zhǎng)生存期25%。而MT-125+舒尼替尼聯(lián)合治療較溶劑組延長(zhǎng)生存期78%（p < 0.0001），較MT-125單藥延長(zhǎng)44%（p < 0.0001，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)）。

參考文獻(xiàn)：

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