CLDN4棕櫚?；龠M(jìn)肝細(xì)胞癌向膽管譜系轉(zhuǎn)化及侖伐替尼耐藥

   肝細(xì)胞癌（HCC）具有顯著的可塑性，能夠通過表型轉(zhuǎn)換促進(jìn)藥物耐受狀態(tài)并規(guī)避藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。本研究發(fā)現(xiàn)，與緊密連接蛋白Claudin 4（CLDN4）相關(guān)的肝向膽管譜系轉(zhuǎn)化（HBT）是緩解HCC侖伐替尼耐藥潛在靶點(diǎn)。CLDN4在侖伐替尼耐藥患者中表達(dá)更為普遍。CLDN4半胱氨酸殘基C104和C107位的棕櫚酰化修飾可調(diào)控賴氨酸殘基K103位的泛素化，抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，并維持CLDN4在脂筏中的錨定。錨定狀態(tài)的CLDN4通過驅(qū)動(dòng)接觸蛋白-1向脂筏募集并激活Notch信號(hào)通路，促進(jìn)HCC細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，從而增強(qiáng)對(duì)侖伐替尼的耐藥性。研究證實(shí)CLDN4抑制劑丹酚酸B能同時(shí)逆轉(zhuǎn)HCC的HBT進(jìn)程和侖伐替尼耐藥性。此外，聯(lián)合化療對(duì)發(fā)生HBT的HCC患者展現(xiàn)出顯著治療效果。該研究于2025年7月發(fā)表在《Cell Reports Medicine》，IF：10.6。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1.CLDN4可作為緩解肝細(xì)胞癌侖伐替尼耐藥的潛在靶點(diǎn)

   為探究侖伐替尼耐藥的關(guān)鍵分子機(jī)制，我們通過體內(nèi)誘導(dǎo)法建立自發(fā)性HCC模型并獲取潛在耐藥細(xì)胞：通過持續(xù)侖伐替尼暴露誘導(dǎo)HCC小鼠產(chǎn)生藥物耐受性，經(jīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證原代HCC細(xì)胞的藥物耐受性增強(qiáng)（圖1A-1E）。收集耐受侖伐替尼的原代細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，同時(shí)采集3對(duì)侖伐替尼耐藥/敏感患者的腫瘤樣本進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序（Fu-LR Sc隊(duì)列）。CLDN4在耐藥患者中表達(dá)上調(diào)最顯著，且是僅有的在耐藥細(xì)胞系和患者中同步上調(diào)的分子（圖1F-1H）。經(jīng)嚴(yán)格質(zhì)控后保留93,776個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq），對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，采用主成分分析和均勻流形近似與投影（UMAP）進(jìn)行降維聚類，再通過拷貝數(shù)變異分析區(qū)分惡性與非惡性細(xì)胞。根據(jù)標(biāo)志基因?qū)⒓?xì)胞群分為9類：上皮/腫瘤細(xì)胞（24,463個(gè)，26.1%，標(biāo)志基因EPCAM/ALDH1A1/ALB）、B細(xì)胞（4,341個(gè)，4.6%，MS4A1/CD79A）、T細(xì)胞（36,264個(gè)，38.7%，CD3D/CD3E）、自然殺傷細(xì)胞（2,168個(gè)，2.3%，F(xiàn)GFBP2）、中性粒細(xì)胞（2,459個(gè)，2.6%，ITGAM/CD33）、巨噬細(xì)胞（12,624個(gè)，13.5%，CD68/CD163/CD14）、單核細(xì)胞（5,898個(gè)，6.3%，ITGAX）、內(nèi)皮細(xì)胞（4,120個(gè)，4.4%，PECAM1）及平滑肌細(xì)胞（1,439個(gè)，1.5%，PECAM1/VWF）。值得注意的是，CLDN4定位于惡性細(xì)胞（圖1I和S1A）。既往研究評(píng)估多株HCC細(xì)胞系對(duì)侖伐替尼的敏感性，將SUN449、JHH1、Huh6等列為耐藥系，SUN398、Huh7等列為敏感系。本研究發(fā)現(xiàn)CLDN4在多數(shù)耐藥系中表達(dá)顯著高于敏感系（圖1J、1K）。為進(jìn)一步驗(yàn)證CLDN4在耐藥中的作用，收集55例術(shù)前接受侖伐替尼治療患者的殘余腫瘤組織（Fu-LR隊(duì)列）及55例直接手術(shù)患者的未治療腫瘤組織。免疫組化顯示CLDN4定位于腫瘤細(xì)胞膜（圖1L、1M），且殘余隊(duì)列中CLDN4陽(yáng)性或疾病穩(wěn)定患者比例顯著高于未治療隊(duì)列（圖1N）。CLDN4高表達(dá)患者術(shù)后預(yù)后較差（圖1O；表S1）。通過采集12例患者治療前活檢樣本發(fā)現(xiàn)，侖伐替尼應(yīng)答組（n=4）腫瘤組織的CLDN4免疫熒光強(qiáng)度顯著低于耐藥組（n=8）（圖1P）。這些結(jié)果表明CLDN4可作為克服HCC侖伐替尼耐藥的潛在治療靶點(diǎn)。

圖1.CLDN4可作為緩解肝細(xì)胞癌侖伐替尼耐藥的潛在靶點(diǎn)

2.CLDN4高表達(dá)與HCC膽管譜系轉(zhuǎn)化及侖伐替尼耐藥相關(guān)

   為探究CLDN4在HCC侖伐替尼耐藥中的特征，我們整合Fu-LR Sc隊(duì)列數(shù)據(jù)集及兩項(xiàng)已發(fā)表研究（圖S1B、S1C）。經(jīng)過嚴(yán)格質(zhì)控過濾后，對(duì)各數(shù)據(jù)集進(jìn)行無監(jiān)督聚類以區(qū)分惡性細(xì)胞，保留高表達(dá)典型惡性細(xì)胞標(biāo)志基因的簇群。最終對(duì)scRNA-seq分析中56例患者的69,711個(gè)惡性細(xì)胞進(jìn)行分類，聚類為12個(gè)不同亞群（圖2A）。所有亞群均呈現(xiàn)不同水平的肝系/膽系標(biāo)志物特征（通過HCC與ICC差異表達(dá)譜確定）。值得注意的是，CLDN4表達(dá)與膽系標(biāo)志物呈正相關(guān)，而與肝系標(biāo)志物呈負(fù)相關(guān)（圖2B、2C、S1D）。為闡明惡性細(xì)胞亞型間的譜系轉(zhuǎn)化與分化潛能，采用Monocle 2和CytoTRACE算法推導(dǎo)偽時(shí)間軌跡和分化水平（圖2D-2F）。隨著CLDN4表達(dá)升高，膽系標(biāo)志物（EPCAM、SOX9、CEACAM1等）逐漸上調(diào)，而肝系標(biāo)志物（載脂蛋白E、白蛋白、纖維蛋白原γ/α鏈等）相應(yīng)下調(diào)，證實(shí)HCC患者存在膽管譜系轉(zhuǎn)化（圖2G、2H）?；蚣患治鲲@示，CLDN4高表達(dá)患者的基因特征與膽管癌（CHOL）基因集呈正相關(guān)，與肝細(xì)胞癌（LIHC）基因集呈負(fù)相關(guān)（圖2I、S1E、S1F）。qPCR分析證實(shí)小鼠CLDN4表達(dá)在胚胎16天達(dá)峰（圖2J），從發(fā)育早期至成熟肝細(xì)胞逐漸下降（圖2K）。在患者組織中，CLDN4表達(dá)從遠(yuǎn)端正常肝組織→癌旁組織→HCC組織逐級(jí)升高，侖伐替尼耐藥腫瘤組織中表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)（圖2L）。值得注意的是，CLDN4水平與腫瘤病理分級(jí)呈正相關(guān)（圖2M）。過表達(dá)CLDN4可上調(diào)所有膽系標(biāo)志物并抑制肝系標(biāo)志物表達(dá)（圖S1G、S1H）。此外，敲低CLDN4能顯著降低HCC細(xì)胞在體內(nèi)外對(duì)侖伐替尼的耐藥性（圖2N-2P、S1I）。這些發(fā)現(xiàn)表明CLDN4過表達(dá)通過促進(jìn)HCC膽管譜系轉(zhuǎn)化介導(dǎo)侖伐替尼耐藥。

圖2.CLDN4高表達(dá)與HCC膽管譜系轉(zhuǎn)化及侖伐替尼耐藥相關(guān)

3.棕櫚?；D(zhuǎn)移酶zDHHC5介導(dǎo)CLDN4在進(jìn)化保守半胱氨酸殘基C104和C107位的S-棕櫚酰化修飾

   既往研究表明脂質(zhì)修飾可能參與claudin蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和緊密連接組裝。例如，與非棕櫚酰化突變體相比，棕櫚酰化CLDN蛋白能更有效地分布到脂質(zhì)雙分子層中。為探究CLDN4的脂質(zhì)修飾，我們提取HCC細(xì)胞系膜組分進(jìn)行棕櫚?；鞍踪|(zhì)組測(cè)序（圖3A-3C）。通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)連接生物素-疊氮化物和?；?生物素交換（ABE）兩種方法證實(shí)HCC中存在棕櫚?；揎棧▓D3D、S2A、S2B）。有趣的是，使用棕櫚?；种苿?-BP處理后，兩種HCC細(xì)胞系質(zhì)膜上的CLDN4表達(dá)顯著降低（圖3E、S2C）。相反，通過酰基蛋白硫酯酶（APT）選擇性抑制劑palmostatin B和ML348增強(qiáng)棕櫚?；?，MHCC97H細(xì)胞中CLDN4表達(dá)增加（圖S2D、S2E）。序列比對(duì)顯示CLDN4的C104、C107、C182、C183和C185位點(diǎn)在不同物種間保守（圖3F、3G）。我們采用基于模組的預(yù)測(cè)工具CSS-palm 4.0預(yù)測(cè)顯示，含C182、C183和C185的CLDN4 C端區(qū)域具有較高棕櫚?；怕省５ㄟ^ABE-質(zhì)譜分析證實(shí)，HCC中CLDN4的實(shí)際棕櫚?；稽c(diǎn)位于跨膜區(qū)（TR）的C104和C107位點(diǎn)（圖3H、3I、S2F-S2H）。這凸顯了算法預(yù)測(cè)與實(shí)際修飾位點(diǎn)之間的差異。

   蛋白質(zhì)棕櫚?；ǔＳ商禺愋宰貦磅＾D(zhuǎn)移酶介導(dǎo)，其選擇性取決于酶的底物特異性、亞細(xì)胞定位、調(diào)控信號(hào)及底物結(jié)構(gòu)特征。例如，位于不同細(xì)胞區(qū)室的棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶僅修飾與其發(fā)生物理相互作用的底物。在HCC中，zDHHC5/7/9/16/17/18/20/21的高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)。為鑒定MHCC97H細(xì)胞中CLDN4的主要棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶，我們?cè)贖EK293細(xì)胞中分別共表達(dá)HA標(biāo)記的zDHHC蛋白與FLAG標(biāo)記的CLDN4。免疫共沉淀結(jié)合免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明zDHHC1/5/20/21/24可與CLDN4結(jié)合（圖S3A）。隨后發(fā)現(xiàn)敲低zDHHC5會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源性CLDN4棕櫚?；较陆担▓DS3B）。因此我們推測(cè)zDHHC5參與CLDN4的動(dòng)態(tài)棕櫚?；?，并利用AlphaFold3進(jìn)行分子對(duì)接建模（圖3J）。ABE實(shí)驗(yàn)證實(shí)zDHHC5促進(jìn)CLDN4在C104和C107位點(diǎn)的棕櫚酰化（圖3K-3N、S3C-S3E）。在Fu-LR隊(duì)列中，zDHHC5高表達(dá)與CLDN4高表達(dá)及HCC患者不良預(yù)后相關(guān)（圖3O、3P、S3F、S3G）。zDHHC5在侖伐替尼耐藥患者和細(xì)胞系中也顯著上調(diào)（圖3Q、S3H、S3I）。敲低zDHHC5后，HCC細(xì)胞對(duì)侖伐替尼的耐藥性在體外顯著降低，反之亦然（圖S4A-S4H）。這些結(jié)果表明zDHHC5介導(dǎo)CLDN4在進(jìn)化保守位點(diǎn)C104和C107的S-棕櫚?；揎?。

圖3.棕櫚?；D(zhuǎn)移酶zDHHC5介導(dǎo)CLDN4在進(jìn)化保守半胱氨酸殘基C104和C107位的S-棕櫚?；揎?/span>

4.CLDN4棕櫚?；瞧涠ㄎ挥谥さ谋匾獥l件

   Claudin蛋白通常定位于脂筏等功能性膜結(jié)構(gòu)域發(fā)揮作用。我們探究棕櫚?；揎検欠衲艽龠M(jìn)CLDN4錨定于脂筏。在2-BP處理或敲低zDHHC5的MHCC97H細(xì)胞中，脂筏上的CLDN4水平顯著降低，該現(xiàn)象可被內(nèi)吞抑制劑Dynasore和溶酶體抑制劑氯喹（CQ）逆轉(zhuǎn)，但蛋白酶體抑制劑MG132無此效應(yīng)（圖4A、4B）。對(duì)CLDN4免疫沉淀物的質(zhì)譜分析提示其與網(wǎng)格蛋白相互作用蛋白1（CLINT1）及溶酶體相關(guān)膜蛋白2（LAMP2）存在相互作用（圖S6A）。由此我們推測(cè)CLDN4通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞（CME）途徑轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體降解。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CLDN4與網(wǎng)格蛋白重鏈（CLTC）及LAMP2的結(jié)合（圖S6B）。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)CLDN4與CLINT1存在直接相互作用（圖4C-4E、S6C、S6D）。正如預(yù)期，敲低CLINT1可有效挽救去棕櫚?；T導(dǎo)的CLDN4降解（圖4F），而蛋白酶體抑制劑MG132未能延緩CLDN4蛋白降解速率（圖S6E）。免疫熒光顯示2-BP和shzDHHC5處理細(xì)胞中CLDN4與CLTC/LAMP2共定位顯著增加，shCLINT1處理細(xì)胞中則明顯減少（圖4G、4H）。但目前尚未闡明為何CLDN4棕櫚?；苡绊慍ME過程——該過程已知受動(dòng)態(tài)泛素化與去泛素化調(diào)控。另有研究表明棕櫚?；勺钄喾核亟Y(jié)合，提示這兩種修飾在分子水平存在交叉對(duì)話與競(jìng)爭(zhēng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑制棕櫚?；@著增強(qiáng)CLDN4與泛素或CLINT1的相互作用（圖4I）。為揭示介導(dǎo)CLDN4泛素化的E3泛素連接酶，我們從CLDN4免疫沉淀物中篩選出三重基序蛋白33（TRIM33）。值得注意的是，敲低TRIM33可升高M(jìn)HCC97H細(xì)胞中CLDN4蛋白水平并降低其泛素化積累（圖4J-4M），而MG132不影響CLDN4結(jié)合的泛素水平（圖S6F）。此外，基于BDM-PUB（貝葉斯判別法預(yù)測(cè)蛋白泛素化位點(diǎn)工具，預(yù)測(cè)結(jié)果，K103位點(diǎn)可能是受棕櫚?；绊懙臐撛趩畏核鼗稽c(diǎn)。K48連接泛素化通常通過蛋白酶體途徑介導(dǎo)降解，而K63連接泛素化介導(dǎo)內(nèi)吞和DNA損傷修復(fù)等過程。我們?cè)贛HCC97H細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)染HA標(biāo)記的K63和FLAG標(biāo)記的K103突變型CLDN4，結(jié)果表明CLDN4 K103位點(diǎn)的泛素化由K63連接泛素鏈介導(dǎo)（圖4N、4O）。綜上所述，CLDN4半胱氨酸殘基C104和C107位的棕櫚?；揎棿龠M(jìn)其錨定于脂筏（圖4P）。

圖4. CLDN4棕櫚?；瞧涠ㄎ挥谥さ谋匾獥l件

5.CLDN4通過激活Notch通路改變腫瘤細(xì)胞可塑性

   合成競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合靶分子棕櫚酰化區(qū)域的肽段是開發(fā)特異性抑制劑的策略之一。我們據(jù)此合成針對(duì)CLDN4棕櫚?；母?jìng)爭(zhēng)性肽CPP-S4，該肽能有效抑制CLDN4的膜穩(wěn)定性并增強(qiáng)侖伐替尼的細(xì)胞毒性效應(yīng)（圖5A-5E、S7A-S7F）。經(jīng)CPP-S4處理的MHCC97H細(xì)胞中，膽管譜系轉(zhuǎn)化（HBT）相關(guān)基因表達(dá)不同程度下調(diào)（圖5F、5G、S7G、S7H）。轉(zhuǎn)錄組分析顯示細(xì)胞從侖伐替尼耐藥特征向敏感特征轉(zhuǎn)變（圖S7I）。值得注意的是，通路富集分析表明Notch相關(guān)信號(hào)通路受抑制最顯著，該結(jié)果通過免疫印跡和qPCR得到驗(yàn)證（圖5H-5I、S7J）。重要的是，CLDN4過表達(dá)引起的HBT標(biāo)志物升高可被γ-分泌酶抑制劑RO4929097顯著逆轉(zhuǎn)（圖5J、5K）。我們進(jìn)一步鑒定發(fā)現(xiàn)NICD（Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域）-RBPJ（重組信號(hào)結(jié)合蛋白Jκ區(qū)）結(jié)合位點(diǎn)位于HBT標(biāo)志物的啟動(dòng)子區(qū)域（圖5L、5M）。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）-PCR及ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)NICD-RBPJ顯著富集于HBT標(biāo)志物啟動(dòng)子區(qū)（圖5N、5O）。設(shè)計(jì)野生型和突變型NICD-RBPJ位點(diǎn)探針進(jìn)行DNA親和沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示NICD-RBPJ僅與野生型HBT標(biāo)志物啟動(dòng)子區(qū)寡核苷酸結(jié)合（圖5P）。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)NICD-RBPJ是HBT標(biāo)志物啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性及基因表達(dá)的必要條件（圖5Q）。綜上所述，這些結(jié)果表明CLDN4通過Notch信號(hào)通路誘導(dǎo)HBT標(biāo)志物表達(dá)。

圖5. CLDN4通過激活Notch通路改變腫瘤細(xì)胞可塑性

6.CLDN4驅(qū)動(dòng)CNTN1向脂筏募集并激活Notch信號(hào)通路

   通過MHCC97H細(xì)胞膜共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)CLDN4與CNTN1而非JAG1存在相互作用（圖6A、6B）——這兩種分子均被報(bào)道可激活Notch信號(hào)。免疫熒光共定位及TCGA-LIHC數(shù)據(jù)表明CNTN1與CLDN4表達(dá)具有一致性（圖6C、6D）。接下來我們探究CLDN4如何通過結(jié)合促進(jìn)CNTN1活性。CNTN1是一種神經(jīng)細(xì)胞黏附蛋白，由6個(gè)N端免疫球蛋白（Ig）結(jié)構(gòu)域和4個(gè)纖連蛋白樣重復(fù)序列組成（圖6E）。通過構(gòu)建帶有FLAG標(biāo)簽的纖連蛋白III樣和Ig樣C2型1突變體，發(fā)現(xiàn)CNTN1的纖連蛋白III結(jié)構(gòu)域參與CLDN4-CNTN1相互作用（圖6F）。由于CNTN1通過糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定在質(zhì)膜上，其幾乎完全定位於脂筏中（圖6G）。因此我們提出假說：棕櫚?；疌LDN4通過招募CNTN1至脂筏激活Notch通路。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CLDN4不影響CNTN1總表達(dá)水平，但顯著改變其在脂筏中的分布（圖6H、6I）。脂筏抑制劑甲基-β-環(huán)糊精（MβCD）顯著降低CLDN4與CNTN1在膜上的共定位，并抑制Notch信號(hào)傳導(dǎo)和膽管譜系轉(zhuǎn)化（圖6J-6N）。下調(diào)CNTN1或添加MβCD可消除CLDN4過表達(dá)HCC細(xì)胞中侖伐替尼半抑制濃度（IC50）的變化，反之亦然（圖6O）。皮下成瘤實(shí)驗(yàn)也證實(shí)MβCD或RO4929097能增強(qiáng)侖伐替尼的抗腫瘤效果（圖6P）。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)棕櫚酰化CLDN4通過驅(qū)動(dòng)CNTN1向脂筏募集進(jìn)而放大Notch致癌通路。

圖6. CLDN4驅(qū)動(dòng)CNTN1向脂筏募集并激活Notch信號(hào)通路

7.通過虛擬篩選發(fā)現(xiàn)CLDN4拮抗劑

   我們隨后嘗試尋找抑制CLDN4的臨床適用方法。首先考慮采用靶向CLDN4的單克隆抗體或抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC）策略向CLDN4陽(yáng)性細(xì)胞遞送細(xì)胞毒性藥物——該策略已應(yīng)用于其他claudin蛋白靶點(diǎn)。但由于CLDN4在食管和胃黏膜等正常上皮組織中高表達(dá)，這兩種方法均不適用于靶向侖伐替尼耐藥HCC，直接靶向殺傷會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重胃腸道副作用。靶向CLDN4的棕櫚酰化修飾可能是更有效的策略。我們收集17681種小分子藥物（Topscience,T001），對(duì)CLDN4-zDHHC5結(jié)合域三維模型進(jìn)行分子對(duì)接。經(jīng)過虛擬篩選和毒性評(píng)估，確定丹酚酸B（SalB）為高效安全的CLDN4拮抗劑（圖7A、7B、S8A-S8J）。為探究SalB對(duì)HCC發(fā)病機(jī)制的影響，我們?cè)赯dhhc5基因敲除（Zdhhc5?/?）小鼠中建立自發(fā)性HCC模型（圖S9A）。與野生型（WT）相比，Zdhhc5?/?小鼠自發(fā)性腫瘤進(jìn)展更慢（肝重/體重比降低），肝損傷更輕（ALT/AST值下降）（圖S9B）。Zdhhc5?/?小鼠HCC組織中CLDN4表達(dá)水平及棕櫚?；潭染@著降低（圖S9C、S9D）。相應(yīng)地，SalB能在不引起顯著肝毒性的前提下抑制WT小鼠腫瘤生長(zhǎng)（圖S9E-S9H）。這些結(jié)果表明SalB是一種有效的CLDN4拮抗劑。

圖7. 通過虛擬篩選發(fā)現(xiàn)CLDN4拮抗劑

8.CLDN4誘導(dǎo)的膽管譜系轉(zhuǎn)化與HCC不良預(yù)后相關(guān)

   為在體內(nèi)模型中驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，我們通過將Hepa1-6細(xì)胞注射至C57BL/6小鼠肝臟建立原位模型。10天后檢測(cè)到腫瘤形成，并給予侖伐替尼、SalB或?qū)φ談┲委?0天。聯(lián)合治療組腫瘤體積顯著減?。▓D7C-7E）。構(gòu)建CLDN4陽(yáng)性侖伐替尼耐藥人源腫瘤異種移植模型（LR-PDXs），SalB顯著增強(qiáng)侖伐替尼在LR-PDXs中的抗腫瘤效果且未觀察到明顯毒性（圖7F-7H）。由于HCC患者通常不似膽管癌（ICC）患者接受化療，混合型肝癌患者是否應(yīng)接受化療尚無明確共識(shí)。我們探究具有膽管譜系轉(zhuǎn)化（HBT）的HCC患者是否能從化療中獲益。結(jié)果表明，盡管伴隨小鼠體重顯著下降，吉西他濱/順鉑聯(lián)合侖伐替尼對(duì)CLDN4+KRT7+EPCAM+ PDXs模型療效最佳（圖S10A-S10D）。值得注意的是，SalB給藥可部分逆轉(zhuǎn)HBT，治療組HBT標(biāo)志物表達(dá)顯著低于對(duì)照組（圖S10E）。而對(duì)于CLDN4?KRT7?EPCAM? PDXs模型，聯(lián)合化療未帶來顯著獲益（圖S10F-S10J）。

   為驗(yàn)證HBT與侖伐替尼耐藥的關(guān)系，我們對(duì)Fu-LR隊(duì)列進(jìn)行多重免疫組化（mIHC）并開展類組織流式分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤微陣列每個(gè)位點(diǎn)單細(xì)胞的定量熒光分析。膽管譜系HCC在殘余隊(duì)列中占比顯著更高，反之亦然（圖7I-7L、S11A、S11B）。此外，肝系與膽系標(biāo)志物表達(dá)模式完全相反，提示HCC中膽管特性與肝細(xì)胞特性相互制約并可相互轉(zhuǎn)化（圖7M）。與無HBT的HCC病例相比，具HBT特征的患者總生存期和無復(fù)發(fā)生存期顯著縮短（圖7N）。綜上所述，HBT與HCC侖伐替尼耐藥及不良預(yù)后相關(guān)，同時(shí)可能從化療中獲益（圖7O）。

結(jié)論：

   該研究揭示了肝細(xì)胞癌（HCC）中緊密連接蛋白4（CLDN4）的棕櫚?；ㄟ^促進(jìn)肝細(xì)胞向膽管細(xì)胞譜系轉(zhuǎn)化（HBT）和激活Notch信號(hào)通路，導(dǎo)致侖伐替尼耐藥的分子機(jī)制。棕櫚?；稽c(diǎn)C104和C107由zDHHC5催化，增強(qiáng)了CLDN4在脂筏中的錨定，抑制了其內(nèi)吞作用，從而維持其在細(xì)胞膜上的穩(wěn)定表達(dá)。棕櫚?；腃LDN4將接觸蛋白1（CNTN1）募集到脂筏中，激活Notch信號(hào)通路，上調(diào)膽管細(xì)胞譜系標(biāo)志物，下調(diào)肝細(xì)胞譜系標(biāo)志物，促進(jìn)HBT。CLDN4的高表達(dá)與侖伐替尼耐藥性密切相關(guān)。Salvianolic acid B（SalB）通過抑制zDHHC5，降低CLDN4的棕櫚酰化水平，減少HBT，恢復(fù)侖伐替尼的敏感性。聯(lián)合化療（如吉西他濱/順鉑）對(duì)發(fā)生HBT的HCC患者可能有效。

參考文獻(xiàn)：

Xu M, Zheng Y, Chen J, Gao C, Zhu M, Ma A, Liang B, Xu W, Fan J, Zhou H, Ke A, Shen Y. CLDN4 palmitoylation promotes hepatic-to-biliary lineage transition and lenvatinib resistance in hepatocellular carcinoma. Cell Rep Med. 2025 Jul 15;6(7):102208.